奶粉中三聚氰胺的测定方法

GC-MS法测定动物食品中的三聚氰胺

Spectra-Quad实现三聚氰胺含量在线检测

超液相色谱_电喷雾串联质谱法测定饲料中残留的三聚氰胺

反相液相色谱法测定饲料中三聚氰胺的含量

液相色谱-二极管阵列法测定高蛋白食品中的三聚氰胺

液相色谱法(HPLC)测定饲料中三聚氰胺的含量

液相色谱-四极杆质谱联用测定饲料中三聚氰胺含量

固相萃取与液相色谱联用测定宠物食品中三聚氰胺

液相色谱串联质谱法(LC-MSMS)分析宠物食品中三聚氰胺

液相色谱-串联质谱法测定饲料中三聚氰胺残留

GC-MS法测定动物食品中的三聚氰胺

测定方法

  本实验中综合各方法稳定性进行比较，主要介绍以下三种：

• 固相萃取（SPE）方法
•  HPLC-UV检测方法
•  LC-MS检测方法（仅供参考）

检测中所需的仪器与条件

•    Agilent1100液相色谱仪(美国，Agilent公司)；二极管阵列检测器(DAD)，检测波长240nm，柱温：40℃。

(1)AgelaVenusilTMASBC18(4.6×250mm)；缓冲液：10mM柠檬酸,10mM庚烷磺酸钠;流动相：缓冲溶液：乙腈=85：15；流速：1.0mL/min。

(2)AgelaVenusilTMASBC8(4.6×250mm)；流动相：缓冲液：乙腈=85：15；缓冲液：10mM柠檬酸，10mM辛烷磺酸钠，调pH为3.0;流速：1.0mL/min； 

•   离子交换固相萃取柱AgelaClearnertTMPCX(北京艾杰尔科技有限公司)

        混合型的阳离子交换柱(Cleanert PCX 60mg/3mL)50支

•    台式高速（微量）离心机 TG16-WS/TG16-W (湖南湘仪离心机仪器有限公司)

（1）角转子: 12＊1.5ml；12＊10ml  转速≥8000rpm/min，微机控制可定时；常温

（2）离心管：10ml.或1.5ml（一套） 

•  三聚氰胺标准品1瓶(250mg,≥99.5％) 

•    三聚氰胺分析方法手册１份

其他试剂

饲料/奶粉样品；甲醇、乙腈；氨水、乙酸铅、三氯乙酸、柠檬酸、庚烷磺酸钠 、辛烷磺酸钠(Sigma公司)；甲醇为色谱纯，其他均为化学纯。

理化性质 

三聚氰胺:英文名"melamine",简称三胺,学名三氨三嗪,别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺。分子式：C3N6H6、C3N3(NH2)3:分子量:126.12

物理性能:白色结晶粉末,无毒,无味;相对密度:1570kg/m³;熔点:在常压下,354℃分解;升华温度：300℃;溶解性:能溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶；微溶于水、乙醇；不溶于乙醚、苯和四氯化碳、苯和四氯化碳，水溶液呈弱碱性

化学性能：三聚氰胺是一种重要的氮杂环有机化工原料，显弱碱性，能够与各种酸反应生成三聚酸二酰胺盐；在强酸或强碱液中，三聚氰胺发生水解，胺基逐步被羟基取代，处成三聚氰酸二酰胺、三聚握酸一酰胺和三聚氰酸；三聚握胺与醛类反应生成加成化合物；三聚氰胺与甲醛反应制成树脂，三聚氰胺树脂，三聚氰树脂是一种多种用途的材料，防水耐热且有很高的稳定性，用于生产塑料、地板砖，厨房用具，防炎纤维，商业滤膜，胶水和阻燃剂。

 固相萃取（SPE）方法

1 固相萃取（SPE）柱的选择： 

三聚氰胺呈弱碱性（弱阳离子化合物），净化过程一般选择阳离子交换柱。混合型的阳离子交换柱（PCX）通过将磺酸基因（-SO₃H）键何在极性高聚物聚苯乙烯/二乙烯苯（PEP）吸附剂上，具有阳离子和反相两种吸附机理，并具有以下优点：

1)               可通过两种不同溶液的洗涤（水/一定pH值的缓冲溶液和有机溶剂），使样品更干净，提高检测的灵敏度。

2)               批次重复性好。

3)               回收率高，重现性好，即使小柱跑干也可以得到较高回收率。

图  PCX结构式

2 样品前处理步骤：

2.1 标准样品配制：

     取50mg三聚氰胺标准品，以20%甲醇溶解定容至50ml得到1000ppm的标准溶液，使用时，以提取液（1%三氯乙酸）稀释至所要的浓度。

2.2 提取

     称取饲料/奶粉样品5g （或牛奶10ml），加入50ml  1%三氯乙酸提取液，充分混匀，加入2ml 2%乙酸溶液，超声20min。然后取部分溶液转移至10ml离心管中，并将其放置于离心机中，启动离心机使转速达到8000rpm/min 离心 10min后，取上清液3mL 过混合型阳离子交换小柱（PCX）。 

2.3 净化（PCX小柱，60ml/3ml）：

   1） 活化及平衡： 3ml甲醇 ，3ml 水

   2） 上样：加入提取液 3ml

   3） 淋洗：3ml 水；3ml甲醇：弃去淋洗液并将小柱抽干。

   4） 洗脱：5ml  5%氨化甲醇（v/v）洗脱。（5%氨化甲醇的配制：5ml氨水+95ml甲醇）。

  5)  浓缩：50°C,氧气吹干，20%甲醇/水定容至2ml。HPLC分析或衍生后GC/MS分析。

HPLC-UV检测方法

三聚氰胺在传统的C18柱上保留很差，需要用离子对试剂色谱方法才能有良好的保留与分离，按照美国食品药品监督管理局（FDA）的三聚氰胺检测方法和中国农业部颁部的三聚氰胺检测方法，采用Venusi ASB系列亲水色谱柱，均能得到良好的结果，分析色谱图如下： 

1、 三聚氰胺的FDA检测方法

色谱柱：Venusil ASB C8 4.6×250mm

缓冲液：10mM辛烷磺酸钠，调Ph为3.0

流动相：缓冲液：乙腈=85：15

进样量：样品用缓冲液溶解成约0.1mg/mL,进10uL

流  速：1.0Ml/min

柱  温：40 °C

波  长：240nm

2、三聚氰胺的中国农业部颁标准检测方法

色谱柱：Venusil ASB-C8 4.6×250mm

缓冲液：10mM柠檬酸，10mM庚烷磺酸钠

流动相：缓冲溶液：乙腈=85：15

进样量：样品用缓冲液溶解成约0.1mg/mL,进10uL

流  速：1.0Ml/min

柱  温：40°C

波  长：240nm

表1 PCX柱回收率

由上表1可以看出：用PCX柱净化样品，可以得到满意的回收率，此方法处理样品，比FDA公布的前处理方法更加准确、可靠。

LC-MS参考方法   LC-MS方法检测三聚氰胺的谱图 

      由于FDA公布的HPLC-UV方法中，流动相添加了离子对试剂，限制了液质联用方法的使用；但不用离子对试剂色谱方法，三聚氰胺在传统的C18柱上保留很差，没有良好的保留与分离。 源于此问题采用Venusil ASB系列亲水色谱柱，不用离子对试剂也能得到有效的保留与分离，参考方法如下：

    缓冲液：10mM NH4AC

流动相：缓冲液：ACN=95： 5

进样量：先用70%ACN溶解成约1mg/mL,用CAN稀释成1.0mg/mL,进10uL

 柱  温：40°C

波  长：240nm 

与FDA2007年4月公布的《UpdatedFCCDevelopmentalMelamineQuantitation(HPLC-UV)》相比较，该方法大大降低了zui低检测限(MSD：0.5ppm；UV：2ppm)，提高了检测灵敏度。

       以该方法分别在ASB-C84.6×250mmASB-C184.6×250mm得到的谱图如下：

结果与讨论

阳离子交换柱(PCX)

    三聚氰胺呈弱碱性(弱阳离子化合物)，净化过程一般应选择阳离子交换柱。混合型的阳离子交换柱(PCX)通过将磺酸基团(-SO3H)键合在极性高聚物聚苯乙烯/二乙烯苯(PEP)吸附剂上，具有阳离子交换和反相吸附两种机理，并具有以下优点：

a)可通过两种不同溶液的洗涤(水/一定pH值的缓冲溶液和有机溶剂)，使样品更干净，提高检测的灵敏度。

b)批次重复性好。

c)回收率高，重现性好，即使小柱跑干也可以得到较高回收率。

      国家食品质量监督检测中心有关人士称，在现有的国家标准奶粉检测中，主要进行蛋白质、脂肪、细菌等检测。三聚氰胺属于化工原料，是不允许添加到食品中的，所以现有标准不会包含相应内容。也就是说，三聚氰胺不属于常规检测项目，正常情况下，很少有人会想到去检测它。